Rejestracja aktywności pojedynczej komórki – po co?

Rejestracja (zewnątrzkomórkowa) aktywności pojedynczych neuronów in vivo jest techniką, która przyczyniła się do znacznych postępów w neurofizjologii (wraz z pokrewnymi neuronaukami). Najczęściej występuje w źródłach jako “(extracellular) single unit recording” i zgodnie z nazwą jej istotą jest pomiar ciągły potencjału elektrycznego w bliskim sąsiedztwie danego neuronu. Celem niniejszego artykułu jest ogólna prezentacja metody oraz pewnych ciekawych wyników otrzymanych dzięki niej. Co prawda nieco odbiega to od tematyki dominującej w tekstach naszej strony, niemniej stanowi on również swego rodzaju wprowadzenie do kolejnego tekstu, dotyczącego przełomu w podobnych formach rejestracji aktywności neuronalnej in vivo. Postęp ten wiąże się z zastosowaniem nanorurek węglowych (CNT).

Kontekst badań na ochotnikach

Do zrozumienia kontekstu i uwarunkowań takich badań warto przyjrzeć się elektroencefalografii wykonywanej śródczaszkowo, co niekiedy łączy się z leczeniem epilepsji. Napady padaczki dzielą się na częściowe (ogniskowe) oraz uogólnione. Napad częściowy rozpoczyna się w pojedynczej obszarze, natomiast uogólnione zachodzą w wielu częściach mózgu. Leczenie chirurgiczne bywa stosowane przy lekoopornych formach padaczki z napadami częściowymi. Wycięcie ogniska wymaga, aby był ono bardzo precyzyjnie zlokalizowane. Choć nawet zwykła elektroencefalografia wystarczy do stworzenia trójwymiarowego obrazu aktywności elektrycznej, obecność kości i innych tkanek silnie obniża jego dokładność i rozdzielczość. Dlatego część takich przypadków wymaga rejestracji EEG przeprowadzanej śródczaszkowo.

Stosowane są do tego trzy typy elektrod. Paskowe i siatkowe (strip and gird) umieszcza się na powierzchni mózgu. Pozwalają one obrazować pole elektryczne przestrzennie i w wysokiej rozdzielczości, ale ich wprowadzenie wymaga pracy przy otwartej czaszce. Elektrody głębokościowe (depth electrodes), mniej inwazyjne, są cienkimi sondami, których zakończenia umieszcza się blisko obszaru zapalnego./1/ Oprócz elektrod EEG można wprowadzić mikroelektrody, zdolne rejestrować potencjał elektryczny w skali umożliwiającej obserwację aktywności jednej komórki. Ognisko często znajduje się w przyśrodkowej części płatu skroniowego (ang. medial temporal lobe, MTL), która zawiera m. in. hipokamp (hippocampus) – strukturę uczestniczącą w przenoszeniu wspomnień z pamięci krótkotrwałej do długotrwałej. Cała przyśrodkowa część płatu jest zaangażowana w wyższe funkcje poznawcze, takie jak formowanie wspomnień i skojarzeń. Z punktu widzenia badaczy jest to dość istotny fakt. Nie dziwi zatem, że wśród pacjentów szuka się czasem ochotników do badań dotyczących tych funkcji.

Pierwszy z podobnej okazji skorzystał pod koniec lat 80. zespół G. A. Ojemanna., chociaż w tym badaniu nie łączono przewodów różnego rodzaju w jednej sondzie. Bezpośrednio przed usunięciem ogniska wprowadzano wolframowe mikroelektrody w skroniową część kory mózgowej. Ochotnikom dawano do wykonania zadania dotyczące nazywania przedmiotów, czytania słów, wykorzystania werbalnej pamięci krótkotrwałej oraz zadanie kontrolne innego rodzaju. W tym badaniu zostało ukazane, że pojedyncze komórki znacząco zmieniają częstotliwość wysyłania impulsów, co ma wskazywać na pewne relacje łączące pamięć i funkcje językowe. /2,4/

Badania dotyczące MTL

 Jakiś czas temu I. Fried z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles (UCLA) rozwinął tę technikę w taki sposób, że elastyczne mikroelektrody zostały umieszczone na końcu głębokościowej sondy EEG. To pozwoliło na obserwowanie aktywności zarówno pojedynczych komórek, jak i większych jednostek przez kilka dni z rzędu, także w stanie przytomności. /3,4/

W ramach tego badania prezentowano ochotnikom zdjęcia i nazwy (w formie tekstu bądź za pomocą syntezatora mowy) łatwych do rozpoznania prawdziwych i fikcyjnych postaci, a także innych obiektów. Okazało się że pojedyncze neurony w hipokampie uaktywniają się pod wpływem bodźców dotyczących jednej postaci, bądź różnych, bezpośrednio ze sobą związanych. Jeden uaktywniał się pod wpływem (tak rozumianych) znaków odnoszących się do aktorki J. Aniston i jej serialowej towarzyszki, inny na Luke’a Skywalkera i mistrza Yodę, a kolejny pod wpływem wszystkich naukowców, z którymi badany miał do czynienia na terenie ośrodka. Natomiast nie zdarzyło się, aby którakolwiek obserwowana komórka uaktywniała się pod wpływem dwu nieskojarzonych ze sobą bodźców. Aktywny neuron wysyłał przez jakiś czas impulsy elektryczne, przykładowo 6 pików w przedziale od 300 ms do 600 ms od włączenia bodźca. /3,5/

Inne obserwacje wiązały się m. in. z odpowiedzią neuronów kory śródwęchowej (cortex entorhinalis) na pobudzenia o czasie trwania w pobliżu progu reakcji. /4/

Dane te wpisują się w dyskusje toczoną od dziesięcioleci przez neurobiologów na temat sposobu kodowania wspomnień przez mózg oraz liczby komórek nerwowych odpowiedzialnych za jedno wspomnienie. Pierwsza z branych współcześnie pod uwagę hipotez mówi że za przywołanie (a wcześniej zakodowanie) jednego wspomnienia odpowiada rozległa sieć setek milionów, a nawet miliardów neuronów rozsianych po obszarze całego mózgu; jest ono rozłożone na fragmenty. Istotna przy tym jest współpraca całej tej sieci, a nie aktywność tej lub tamtej komórki. Alternatywna hipoteza głosi, że każdemu pamiętanemu pojęciu podstawowemu (nie wspomnieniu, bo ono jest korelatem pojęć, a także czysto zmysłowych wrażeń w rodzaju koloru) odpowiada skupiony klaster, złożony z mniejszej liczby komórek, przypuszczalnie rzędu dziesiątek tysięcy. (Klastry te mają się znajdować w przyśrodkowym płacie skroniowym.) Przez pojęcie rozumiem tutaj to, co łączy różne obrazy danego obiektu w to, co jest wywoływane w skojarzeniu, przykładowo kawiarnia (jako taka) czy jakaś znana nam osoba (bez dalszych dookreśleń). Skojarzenia, a dalej obrazy i wspomnienia są zbudowane z łączących się ze sobą pojęć. Według hipotezy klastrowej pojęcia odpowiadają pewnym skupionym grupom neuronów. Skojarzenia są kodowane dzięki temu, że klastry nakładają się na siebie, innymi słowy część komórek reagujących na bodziec związany z pojęciem A uaktywnia się również pod wpływem bodźca związanego z pojęciem B. “Skłonność komórek do reagowania w zetknięciu z powiązanymi pojęciem może stanowić podstawę do tworzenia epizodycznych wspomnień (takich jak określona kolejność zdarzeń podczas spotkania ze znajomymi w kawiarni) bądź strumienia świadomości przepływającego swobodnie od jednego pojęcia do drugiego”, piszą autorzy 3. źródła.

Hipoteza klastrowa, której te wyniki dają znaczące podparcie, została niedawno dodatkowo wzmocniona przez badania na modelach. Okazało się, że tworzenie połączeń między reprezentacjami pojęć w sieciach rozległych jest bardziej zawodne i dużo wolniejsze niż w sieciach o strukturze klastrowej; ponadto dodanie nowego elementu do systemu klastrowego nie wpływa znacząco na pozostałe składniki. /3/

Perspektywy

Podobnego rodzaju badania przeprowadza się również na zwierzętach, w tym małpach. Niemniej tylko ludzie mogą dać szczegółowy opis swojego doświadczenia, a także wykonywać różnorakie zadania bez potrzeby poprzedzenia ich przewlekłym treningiem. Tego typu metody mają przed sobą pewne perspektywy. Podobne próby, jak przekonuje autor 4. źródła, są możliwe i uzasadnione klinicznie również dla innych struktur korowych i podkorowych. Co bardziej interesujące, możliwy jest postęp sprzętowy – w czerwcu 2013 została opublikowana praca dotycząca mikroelektrod wykonanych ze wspominanych już nanorurek węglowych (zastosowanych jak na razie do mysich komórek). Takie mikroelektrody są znacznie cieńsze od znanych dotychczas metalowych i szklanych.

Źródła:

/1/ Depth, Strip and Grid Electrode Placement for EEG Monitoring in Partial Seizures

http://www.uwhealth.org/healthfacts/B_EXTRANET_HEALTH_INFORMATION-FlexMember-Show_Public_HFFY_1105110029748.html

/2/ http://brain.oxfordjournals.org/content/111/6/1383.abstract

/3/ Komórki pamięci (R. Quian Quiroga, I. Fried, C. Koch)

Świat Nauki 03.2013

/4/ Single-Neuron Recordings in Epileptic Patients (R. Quian Quiroga)

http://www.vis.caltech.edu/~rodri/papers/acnr.pdf

/5/ Invariant visual representation by single neurons in the human brain (R. Quian Quiroga, L. Reddy, G. Kreiman, C. Koch, I. Fried)

http://papers.klab.caltech.edu/175/1/519.pdf

Dziękuję Michałowi Szczęchowi (WUM) za cenne uwagi.